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EAE模型建立

更新時間:2016-09-20      點擊次數:7749

EAE模型是一種以特異性致敏的CD4+T細胞介導為主的,以中樞神經系統內小血管周圍出現單個核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病,是人類多發性硬化(MS)的理想動物模型,在臨床神經免疫學的研究中具有重要意義。

實驗動物的選擇

國內外學者試用多種易感動物建立EAE模型,以期闡明MS及EAE的發病機制,并為其病情的監測、復發的預防、治療方案的選擇以及新療法或新藥物的篩選等提供可靠依據。本文就近年來EAE模型方面的研究綜述如下。

 

EAE模型1.1 品系

鳥類哺乳類的多種動物如、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、、等均可成功誘發EAE,但不同種屬或同一種屬不同品系動物的敏感性有很大差異。對EAE敏感的動物有Lewis、DA大鼠,PL/J、SJL/J小鼠,Hartley、Strain13豚鼠。雖然豚鼠對誘發EAE相當敏感,但其品系復雜,有關試劑缺乏,一般不常用作實驗對象。相比之下大鼠及小鼠的背景知識及相關試劑則較為全面,遺傳學、免疫學等方面的研究也較深入,且其EAE在臨床、病理、免疫及生化改變等方面都與人類脫髓鞘疾病較為相似,因此應用。

用大鼠制備EAE有許多優點,如品系多,選擇余地大,繁殖快,同一品系中個體間差異小,實驗方便。其中Lewis大鼠誘發的EAE具有穩定性好、敏感性高等特點,其病程為單相,多數可自行恢復,對再次誘發很快產生強的耐受性,多用作EAE激發和緩解機制的研究。而SJL/L及PL/J小鼠對再次誘發的敏感性沒有明顯降低,且幾乎可見到人類MS的所有病理改變,可誘發出更接近于人類MS的緩解復發型EAE模型,但它的EAE發生率及潛伏期變化較大。人們對小鼠的遺傳背景了解得比較清楚,因此小鼠更適用于有關基因、細胞間作用等領域的研究。然而不同品系小鼠對EAE的敏感性也不同,有人將其分為EAE—易感(EAE—susceptible)和EAE—抵抗(EAE?resistant)兩種類型。基因型分析結果表明,單倍型為H?2s的小鼠(如SJL/J)及H?2q的小鼠(如DBA1/J)屬于EAE—易感型。C57BL/10J及P/J小鼠可發生輕微的脫髓鞘病變。BABL/C和AKR/J小鼠基本不發生EAE,被認為是EAE—抵抗小鼠。

不同品種或同一品種不同品系動物對EAE的易感性主要受免疫反應基因(Ir基因)影響,Ir基因的調節作用表現為T細胞表面受體對髓鞘堿性蛋白(MBP)的特異性表達。動物的種類不同,其受體表達能力不同,對自身抗原的反應性不同,因而對EAE的易感性也不同,因此在選擇動物時需要尋找EAE模型的敏感動物。

鑒于對EAE敏感的Lewis、DA大鼠,PL/J,SJL/J小鼠的價格昂貴、不宜獲得且難以飼養,國內多采用價廉易得的Wistar大鼠,但其敏感性不及前者。

1998年Jon等用猴建立了EAE動物模型,與嚙齒類EAE模型相比,其特征更接近人類脫髓鞘疾病MS,并能以磁共振評估白質損害和神經組織病理改變。

EAE發病有多種誘發因素,包括食物、藥物及感染等。大鼠的飼養環境級別越高,清潔度越高,接觸誘發因素的幾率越小,在相同條件下致敏,其發病率就越低,因此選用普通動物即可。zui近有報道說明,EAE的發病還與動物的血腦屏障的形成有關。

 

EAE模型

1.2 年齡

EAE的發生發展與年齡密切相關。幼齡動物發病后癥狀很快達到高峰,隨后又迅速恢復,和成年動物相比病程較短,其抗原注射部位及CNS內的炎性細胞浸潤程度較輕,并且幼齡動物體重偏小,一般情況差,易出現麻醉意外而死亡。若動物體重(周齡)偏大,則發病延遲,且癥狀較重,所以選擇受試動物以青年期為佳。但若作為抗原提供者,其年齡可適當放寬,一般大于4周即可。

 

EAE模型

1.3 性別

MS多為青年女性,EAE的發生發展也存在性別差異。一般來講,雌性動物較雄性敏感,表現在雌性動物的發病率高,臨床癥狀相對嚴重,如Wistar大鼠及SJL/J小鼠,但也有的動物如Lewis大鼠,雄性較雌性敏感。另外實驗時間選擇在夏季比冬春季節誘導動物模型的敏感性更高。敏感性高的動物,有時癥狀較嚴重且死亡率高,應引起注意。

 

EAE模型抗原的選擇

常用的致敏抗原有髓鞘堿性蛋白(MBP)或其多肽片斷(如MBP peptide 89—101)以及蛋白脂(PLP)等。長期以來MBP和PLP被認為是引起EAE和MS的主要抗原,MBP是髓鞘中抗原性zui強的蛋白質,占髓鞘總蛋白的40%,等電點在10以上,是強堿性蛋白質。研究表明MBP可激活體內Th+細胞,使之穿過血腦屏障,攻擊自身神經髓鞘的MBP,從而導致中樞神經白質脫髓鞘,引起EAE或MS。近年來多用MBP肽代替MBP免疫動物。PLP是高度疏水的膜蛋白,對PLP不同肽決定簇發生反應的CD4+T細胞能誘導急性、慢性復發型及慢性進展型EAE。在MS患者體內也發現與PLP抗原決定簇發生反應的T細胞

zui近研究表明,體內含量較少的髓蛋白,如髓寡樹突細胞糖蛋白(MOG)、髓堿相關糖蛋白(MAG)等也是很強的抗原。髓鞘素(Myelin)、脊髓組織勻漿(SCH)、腦組織勻漿(BH)等也可作為致敏抗原。某些非髓性蛋白,如神經原蛋白(neuronal protein,S100β)、膠原纖維酸蛋白(GFAP)也參與EAE的發病。

通常不同品種動物對同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同,并且不同來源的同一抗原的活性也有明顯差異。一般情況下,抗原性強弱依次為豚鼠脊髓>大鼠脊髓>牛脊髓,脊髓組織>腦組織,豚鼠MBP>牛MBP。蛋白或多肽單體不但結構明確,而且可以定量,因此利于進行EAE發病機制研究,但不易獲得。脊髓勻漿和腦組織勻漿兩種抗原均含有多種抗原表位,且易于獲得,適用于多種動物,但其成分復雜,不易定量,這給某些特殊研究造成不便。誘導鼠類產生EAE的異種抗原,以新鮮豚鼠脊髓制備的抗原佐劑乳化物為。在一定范圍內抗原的量和EAE的發病率及發病程度有相關性,注射抗原佐劑乳化物的劑量越大,EAE的發病率越高。抗原的劑量可因動物的品系、抗原種類、免疫方法、研究目的等的不同而有很大變化。另外,抗原的物理狀態也很重要,高分散度的抗原易于被吞噬和遞呈,進而較率地激活免疫系統。

 

 

EAE模型佐劑的選擇

提取的抗原需與佐劑混合制成抗原乳劑后才能致敏動物??乖魟榉翘禺愋悦庖咴鰪妱?,它可改變抗原的物理性狀,延長抗原在體內的儲留時間,刺激抗原提呈細胞及淋巴細胞,從而增強和擴大免疫應答效果,它還能引起遲發性血腦屏障通透性增加和自身免疫反應。zui常用的佐劑為*弗氏佐劑(CFA),CFA在提高抗體的幅度和持久性方面是當今作用zui強的佐劑。國外一般均采用人型結核桿菌(H37Ra)作為弗氏佐劑。不同實驗室所用的致敏抗原及佐劑中分枝結核桿菌蛋白濃度有所差別,提高結核桿菌的濃度,可提高EAE 的發生率及復發率,但也容易引起注射部位壞死。由于H37Ra在國內不易獲得,常采用廉價易得的卡介苗(BCG)來代替。

百日咳桿菌疫苗(BPV)毒素能增加血管壁的通透性和血管表面粘附分子的表達,有利于致敏的T細胞透過血腦屏障,攻擊神經髓鞘,造成對腦、脊髓組織的免疫損傷。于FCA中加入BPV可明顯縮短Wistar大鼠EAE的潛伏期,提高其發病率,加重其臨床癥狀,對EAE有明顯的促發作用。在用GPSCH誘導Wistar大鼠EAE的同時,給予BPV 可使EAE的潛伏期、發病率、臨床癥狀、體重及病理改變等方面與敏感的Lewis大鼠EAE的上述表現近似。

 

EAE模型模型制備方法

EAE是實驗動物通過神經組織(其中的某些成分)或病毒誘導產生的。EAE的誘導有主動誘導法和被動誘導法兩種。不同的免疫方法,可影響抗原遞呈,激發不同的免疫反應,這不但影響EAE的發生率,還可影響其發展與轉歸。

通常采用主動誘導法制備EAE模型,將抗原與佐劑的混合乳劑直接注射至動物體內,經過一定時間的潛伏期,誘導EAE的產生??乖⑸洳课坏牟煌?,可影響EAE的發生率、潛伏期、死亡率及復發率。常用的注射部位有腳墊、頸部及背部(皮下、皮內、肌肉)、腹腔和尾靜脈等多種,其中以皮下多點注射及腳墊注射的發病率zui高,而頸部注射則有較高的復發率。 因多次注射易引發免疫耐受,現在多采用單次注射抗原法。

EAE的被動轉移實驗是研究其發病機制的zui直接證據,也是研究EAE的治療及預防措施的良好模型。將抗原激活的PLP特異性T細胞轉輸給同一品系的正常大鼠或小鼠,也可引起EAE。MBP特異性自身反應性T細胞在MS的發病機制中也起著關鍵作用,T細胞必須先在外周活化,通過血管內皮細胞進入CNS才能致病。

 

EAE模型臨床表現

 

EAE模型5.1 癥狀分級

EAE的神經癥狀通常根據Kono等提出的標準分為5級。0級:無任何臨床癥狀;1級:動物尾巴無力,2級:尾部無力+肢體無力,3級:肢體輕度麻痹,4級:肢體嚴重麻痹,被動翻身后不能復原;5級:瀕死狀態或死亡。

 

EAE模型5.2 發病過程

抗原誘導EAE后,如果發病,一般都在注射抗原佐劑乳化物后10d左右開始出現癥狀,第2~3周癥狀達高峰。有報道Lewis大鼠用豚鼠全脊髓勻漿誘發EAE時其潛伏期為12.1 dpi(10~14 dpi),發病率為51/53,臨床評分一般在2.5~3.5分左右。采用BCG和Wistar大鼠建立的EAE模型,其發病率穩定在50%左右。存活者常在注射抗原后3周左右癥狀自行緩解,一月左右基本恢復。隨癥狀緩解,體重也逐漸恢復。如果注射抗原3周后未出現EAE癥狀,則不再發病。

 

EAE模型小結

EAE是由針對CNS髓鞘發生免疫攻擊的CD4+Th1細胞介導的自身免疫性疾病,抗原致敏的T細胞穿過血腦屏障進入中樞,誘發對自身髓鞘抗原的免疫應答,導致腦及脊髓的免疫損傷。EAE是人類MS的經典動物模型,通過對EAE發病機制、病情發生發展規律、臨床及病理改變、治療及預防等方面的深入研究,能夠為MS的治療提供充分的實驗依據。

 

 

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