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neuroprobe Z02說明書

更新時間:2020-04-22      點擊次數:848

neuroprobe Z02說明書

神經探針Z02

  • 一般說明
  • 使用Z02的視覺檢測,由Sally Zigmond提供
  • 故障排除
  • 注意和警告

一般說明

在對使用Z02腔室的過程進行一般描述之后,將給出描述該腔室在特定類型的實驗中的用途的特定協議。

通常,將一滴懸浮的細胞放在蓋玻片的中間。電池粘附后,將干玻璃的末端擦干,在6mm寬的濕部分留有粘附的電池。

將以此方式制備的蓋玻片倒置到帶凹槽的顯微鏡載玻片上,以使細胞覆蓋部分位于凹槽之間的橋上方。安裝夾具后,將細胞懸浮介質和趨化因子吸移到兩個凹槽中,直到充滿并沒有氣泡為止。

然后孵育室。

經過適當的時間(取決于細胞類型和實驗目標)后,將玻片置于顯微鏡下,觀察并定量細胞的方向。遷移細胞的內部結構也可以通過使用高功率光學顯微鏡來研究。

使用Z02的視覺檢測,由Sally Zigmond提供

  1. 每次使用前都要清潔腔室。用組織培養清潔劑在溫水中洗滌,用蒸餾水沖洗干凈并擦干。也可以用70%或95%的ETOH擦拭橋接器。
  2. 在22mm x 40mm蓋玻片的中心放置一滴血(例如,用手指刺)。必須在每個蓋玻片上放置足夠的血液,以使其凝結并部分縮回而不干燥。每個蓋板玻璃大約需要100 µL。
  3. 將帶血的蓋玻片放在有或沒有CO 2的 37°C的潮濕室內(例如,裝有濕濾紙的培養皿中)。
  4. 大約45分鐘后,血液凝結并開始收縮,并且在邊緣周圍可見液體。此時,可以用0.9%的鹽水輕輕沖洗掉血和紅細胞。單層細胞(主要是嗜中性粒細胞)保留在蓋玻片上。不要讓細胞干燥。
  5. 通過將明膠溶解在沸騰的去離子水中制備10%的明膠原料。加熱原料使其熔化,并用已除去碳酸氫鹽的Hanks培養基以1:10的比例稀釋,并用pH 7.2的HEPES緩沖液(2.40 g HEPES /升)代替。用Hanks稀釋時,請確保明膠確實在溶液中。該介質是弱酸性和低滲的。這些條件有助于良好的細胞運動。堿性pH和高滲具有抑制作用。
  6. 用幾滴這種孵育培養基沖洗蓋玻片上的細胞層??焖倥懦錾w玻片上的液體,用Kimwipe擦干蓋玻片的端部,然后將蓋玻片倒置到培養箱中,使細胞位于橋上。
  7. 將夾子放在玻璃顯微鏡蓋玻片組件的每一側。不要移動防護玻璃 ; 任何移動都會溶解橋上的細胞。腔室組件需要一些練習。在細胞上的液體少(但不允許細胞干燥)的情況下,蓋玻片和橋之間的距離將非常薄;5微米是宜選擇(細胞會出現輕微擠壓)。如果該間隙太大,則細胞將不能很好地定向??梢允褂蔑@微鏡的微調旋鈕上的千分尺,通過橋頂部和蓋玻片底部之間的焦平面差來測量間隙。通過練習,您可以從一側放下防護玻璃。這有助于消除橋上的氣泡;它們會干擾細胞方向。
  8. 蓋好玻璃蓋后,用移液管吸取100 µL介質到其中一個凹槽的開口端。用移液管吸取100 µL趨化因子(或陰性對照室的細胞懸浮介質)到另一個槽中。
  9. 在37°C下孵育約20分鐘,以使細胞產生反應。(對于其他細胞類型,可能需要更長的孵育時間。)
  10. 使用40X相的物鏡觀察橋上的單元并評估單元方向。方向可以通過細胞形態來評分。運動細胞的前部有寬闊的lamellipodium,而尾巴則較細,可以呈球形或拉入回縮纖維。如果腔室在室溫下冷卻一段時間,則細胞會聚攏并且更難以刻劃。當細胞運動良好時,方向容易得分。
  11. 方向應在橋的特定位置(趨化劑側,中間或介質側)評分。取向水平可以在橋的整個寬度上變化很大,這取決于化學引誘劑的濃度。沿著橋掃描給定的腔室,直到至少刻劃了100個細胞。

故障排除

許多偽像可以更改在給定字段中看到的方向級別。

  1. 與氣泡和細胞團相鄰的細胞趨于特異。這些因素改變了化學梯度的影響。
  2. 如果細胞不形成極化形態,則它們可能死在橋上,但在凹槽上還活著。這可能是由于橋臟造成的,或者制備物太薄以至于細胞實際上已經被溶解了。
  3. 如果細胞形成極化形態但沒有定向,請檢查橋和蓋玻片之間的間隙是否足夠薄。如果間隙合適,請嘗試使用其他濃度的化學引誘劑。

注意和警告

Zigmond玻璃滑動腔非常脆弱,很容易折斷,因此在操作和使用時要格外小心。固定蓋玻片的夾具具有可插入顯微鏡載玻片孔中的銷釘。貼合性好,因此要取下它,可能需要在提起夾具時順時針旋轉旋鈕。切勿嘗試撬開銷釘。

腔室配有一個小內六角扳手。如果銷釘不太容易擰出,請將其翻轉過來,將扳手插入銷釘底部的六角孔中,然后將其旋轉。與拉動銷釘相反,轉動銷釘可大程度地減少碎玻璃的機會。

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