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Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子(FGF-21)ELISA
目錄號：
F2131-K01（1 × 96孔）
僅供研究使用。不得用于診斷程序。
v. 1.0
EagleBiosciences,Inc.
Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒（酶聯免疫分析試劑盒）預期用于定量測定血清中人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)的水平。Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒僅供研究使用，不用于診斷程序。
成纖維細胞生長因子21(FGF-21)屬于FGF-19亞家族，包括FGF-19、FGF-21和FGF-23。FGF-19家族成員是調節多種生理穩態的強效內分泌激素。
完整的FGF-21是由181個氨基酸組成的小蛋白。在一系列胰島素抵抗動物模型中，給予重組FGF21可降低血糖和胰島素水平，降低肝臟和循環甘油三酯和膽固醇水平，并改善胰島素敏感性、能量消耗、肝臟脂肪變性和肥胖。FGF-21的生理功能依賴于其N末端和C末端區域的完整分子結構和氨基酸序列。N端截短的FGF-21(7-181)是一種強效抑制劑，可競爭性抑制完整FGF-21(1-181)的生物活性。因此，測量循環完整FGF-21水平在生理和病理生理狀況評估中具有重要意義。測定FGF-21片段的試驗可能高估供試品中蛋白的生物活性。
循環FGF-21是一種生物標志物，在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和肥胖患者中其水平升高。在庫欣綜合征患者、HIV-1誘導的脂肪代謝障礙患者和慢性腎病或終末期腎病(ESRD)患者中也發現循環FGF-21增加。
試驗原理
Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒的設計、開發和生產用于定量測定血清和EDTA血漿樣本中的人完整FGF-21。該試驗采用雙位點“夾心”技術和與人完整FGF-21不同表位結合的兩種選定抗體。其中一種抗體與N-末端人FGF-21(1-7)特異性結合，另一種與C-末端人FGF-21(175-181)特異性結合。
將試驗標準品、對照品和患者樣本直接加入包被抗人FGF-21(1-7)特異性抗體的微孔板孔中。同時，向各孔中加入辣根過氧化物酶結合的抗人FGF-21(175-181)特異性抗體。一個孵育期后，微量滴定孔壁上的抗體捕獲樣本中的人FGF-21，并洗去每個微量滴定孔中的未結合蛋白。形成“抗FGF-21抗體人完整FGF-21 HRP結合示蹤抗體”的“夾心”。在隨后的清洗步驟中除去未結合的示蹤抗體。為檢測該免疫復合物，將微孔與底物溶液在定時反應中孵育，然后在分光光度酶標儀中測定。與微量滴定孔壁上人完整FGF-21結合的免疫復合物的酶活性與樣本中完整FGF-21的量成正比。通過繪制吸光度與相應人完整FGF-21濃度的曲線生成標準曲線
直接根據該標準曲線測定供試品中的FGF-21。
接收后，該完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒必須儲存在2-8 ℃下。關于試劑盒的失效日期，請參閱試劑盒包裝盒上的標簽。所有組分在失效日期前均保持穩定。
使用前使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得合并或互換。
一個微孔板，含有12 x 8孔可破碎條帶（共96孔），包被有人FGF-21抗體。將板框定并密封在含有干燥劑的箔拉鏈袋中。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
一個小瓶含有0.4 mL濃HRP標記的抗人FGF-21抗體（穩定蛋白基質中）。使用前，必須用FGF-21示蹤劑抗體稀釋劑稀釋該試劑。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
一個含有8 mL即用型緩沖液的小瓶。根據測定程序，應僅用于示蹤抗體稀釋。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
每瓶含30 mL 30倍濃縮液。使用前，必須用870 mL去離子水稀釋內容物，并混勻。稀釋后，得到含有表面活性劑的工作清洗液，溶于含有非疊氮化物、非汞防腐劑的磷酸鹽緩沖鹽水中。稀釋液應在室溫下儲存，并在試劑盒上顯示的失效日期前保持穩定。
一瓶含有12 mL四甲基聯苯胺(TMB)和穩定的過氧化氫。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
每瓶含12 mL 0.5 M硫酸。該試劑應儲存在2-8 ℃或室溫下，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
6個小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21，溶于凍干牛血清基質中，基質中含非疊氮化物、非汞防腐劑。各標準品的準確濃度參見小瓶。標準品可直接使用。這些試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。
兩個小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21，溶于凍干牛血清基質中，含非疊氮化物、非汞防腐劑。有關各質控品的準確濃度范圍，請參見小瓶。質控品準備就緒。兩種質控品均應儲存在2-8 ℃下，并在試劑盒包裝盒上標注的失效日期前保持穩定。
人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)檢測試劑盒試劑必須在專業實驗室環境中使用，且僅供研究使用，不得用于診斷程序。僅牛血清試劑來源的原材料來自美國連續48個國家。僅從獸醫監督下飼養的供體健康動物中獲得，發現無傳染病。進行本試驗時佩戴手套，并將這些試劑視為具有潛在傳染性進行處理。避免接觸含有TMB、過氧化氫或硫酸的試劑。TMB可能會刺激皮膚和粘膜，引起皮膚過敏反應。TMB是一種疑似致癌物。硫酸接觸皮膚可能引起嚴重刺激。請勿接觸眼睛、皮膚或衣服。請勿攝入或吸入煙霧。接觸后，用大量水沖洗至少15 min。使用藥物非臨床研究質量管理規范。
· 能夠遞送25µL、50µL、100µL和1000µL的精密單通道移液器
· 重復適用于遞送100µL的分配器。
· 適用于上述體積分配的一次性移液器吸頭。
· 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。
· 帶蓋的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。
· 鋁箔。
· 去離子水或蒸餾水。
· 塑料微量滴定孔蓋或聚乙烯膜。
· ELISA多通道洗瓶或全自動（半自動）洗滌系統。
· 能夠讀取450 nm處吸光度的分光光度酶標儀。
僅需要50µL人EDTA血漿用于單峰人FGF-21測定。標本采集前無需對個體進行特殊準備。應使用紫色蓋的真空采血管采集全血，并通過離心（850-1500xg離心10 min）將血漿與細胞分離。應在采集后立即或至少在采血后1小時內將血漿與細胞分離。離心后應立即將血漿轉移至潔凈試管中。如果在48小時內不進行測定，血漿樣本應儲存在-20 ℃下。避免標本凍融循環超過3次。
血清樣本也可用于FGF-21測定。血清樣本采集應按照樣本采集管制造商的建議進行。
收集的EDTA-血漿或血清樣本應在冷凍條件下用干冰運送至實驗室。如果冷凍條件不可用，樣本應在
冷藏運輸，例如，使用藍色冰袋運輸。
1. 使用前，使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得組合或互換。
2. 使用前，必須將ELISA清洗濃縮液稀釋至工作溶液。詳細信息請參見試劑章節。
試紙編號。 | FGF-21示蹤抗體稀釋液 | FGF-21示蹤抗體 |
1 | 500 µL | 25 µL |
2 | 1000 µL | 50 µL |
3 | 1500 µL | 75 µL |
4 | 2000 µL | 100 µL |
5 | 2500 µL | 125 µL |
6 | 3000 µL | 150 µL |
7 | 3500 µL | 175 µL |
8 | 4000 µL | 200 µL |
9 | 4500 µL | 225 µL |
10 | 5000 µL | 250 µL |
11 | 5500 µL | 275 µL |
12 | 6000 µL | 300 µL |
試驗程序
1. 將足夠數量的鼠IgG包被微孔板條/孔置于支架中，以一式兩份運行人FGF-21標準品、對照品和未知樣品。
2. 測試配置
世界其他地區 | 試劑條1 | 試劑條2 | 試劑條3 |
A | 標準品1 | 標準品5 | 樣本1 |
B | 標準品1 | 標準品5 | 樣本1 |
C | 標準品2 | 標準品6 | 樣本2 |
D | 標準品2 | 標準品6 | 樣本2 |
E | 標準品3 | C 1 | 樣品3 |
F | 標準品3 | C 1 | 樣品3 |
G | 標準品4 | C 2 |
|
H | 標準品4 | C 2 |
|
3. 向微孔中加入50µL標準品、對照品和患者血漿/血清樣本。
4. 向各孔中加入50µL 1:21稀釋的示蹤抗體
5. 用封板覆膜覆蓋微孔板，并在室溫下通過定軌振搖170 rpm孵育微孔板2小時。
6. 取下封板膜。吸取各孔內容物。向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出內容物?；蛘?，可以使用自動微孔板洗板機。
7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。
8. 用封板覆膜覆蓋微孔板，同時用鋁箔覆蓋，避免暴露于光照下。平板在室溫下孵育20 min。
9. 取下鋁箔和封板膜。向各孔中加入100µL ELISA終止液。輕輕混合。
10. 在酶標儀中讀取450/650 nm下10 min內的吸光度
1. 建議所有標準品、對照品和未知樣品重復測定兩次。每份重復樣本的平均吸光度讀數應用于數據簡化和結果計算。
2. 將光敏試劑保存在原始琥珀色瓶中。
3. 將任何未使用的抗體包被條儲存在含有干燥劑的箔拉鏈袋中，以防止受潮。
4. 為確保試驗的重現性，必須采用仔細的技術并使用適當校準的移液裝置。
5. 除本說明書中規定的孵育時間或溫度外，其他孵育時間或溫度可能影響結果。
6. 避免微孔中出現氣泡，因為這可能導致結合效率較低和重復讀數的CV%較高
7. 所有試劑在使用前應輕輕充分混勻。避免起泡。
1. 計算每對重復檢測結果的平均吸光度。
2. 從所有其他讀數的平均吸光度中減去STD 1(0 ng/mL)的平均吸光度，得到校正吸光度。
3. 通過所有標準品的吸光度生成標準曲線。還可使用適當的計算機輔助數據簡化程序進行結果計算。
使用各自的校正吸光度，直接從標準曲線讀取對照品和患者樣本的人完整FGF-21濃度。
顯示了人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒的典型吸光度數據和所得標準曲線。不得使用該曲線代替每次試驗的標準曲線運行。
孔I.D. |
OD 450/650 nm吸光度 |
結果pg/mL | ||
| 讀數 | 平均值 | 已糾正 |
|
0 pg/mL |
0.037 0.036 |
0.037 |
0.000 |
|
32.5 pg/mL | 0.087 0.086 | 0.087 | 0.050 |
|
91 pg/mL | 0.172 0.169 | 0.170 | 0.133 |
|
255 pg/mL | 0.398 0.399 | 0.399 | 0.302 |
|
714 pg/mL | 1.067 1.069 | 1.068 | 1.031 |
|
2000 pg/mL | 2.835 2.903 | 2.869 | 2.946 |
|
對照1 | 0.126 0.129 | 0.127 | 0.371 |
|
|
|
| 60.83 | |
對照2 | 0.736 0.721 | 0.729 | 1.200 |
|
|
|
| 481.29 | |
用該人完整FGF-21 ELISA測定32份正常成人血漿樣本。發現正常范圍小于200 pg/mL。強烈建議各實驗室根據正常供體EDTA血漿或血清樣本建立自己的正常范圍。
1. 由于沒有可用于人完整FGF-21測量的金標準濃度，因此通過與高純度FGF-21標準品的相關性確定試驗標準品的值。
2. 對于讀數高于高標準的樣本值，建議使用稀釋液重新測定樣本。
3. 血漿標本或試劑的細菌或真菌污染，或試劑之間的交叉污染可能導致錯誤的結果。
4. 用聚酯樹脂去離子的水可能使辣根過氧化物酶失活。
為確保結果的有效性，每項試驗應包括具有已知人完整FGF-21水平的適當對照。我們建議，除本試劑盒提供的檢測試劑盒外，所有檢測試劑盒還包括實驗室自己的FGF-21對照。
靈敏度(LoD)
通過比20次零標準品重復測定的平均值高2倍標準差的相應OD值測定的該人完整FGF-21 ELISA的靈敏度（低）為1.7 pg/mL。
該試驗表明，高達20,000 pg/mL時無任何高劑量“鉤狀”效應。
通過在單次測定中測量3份供體EDTA血漿樣本（重復測定16次），驗證試驗內精密度。
人完整FGF- 21值(pg/mL) |
CV (%) |
63.2 | 5.7 |
171 | 4.2 |
480 | 5.4 |
通過在12次單獨試驗中一式兩份測定3份對照樣品，驗證試驗間精密度。
人完整FGF- 21值(pg/mL) |
CV (%) |
69.8 | 6.9 |
181 | 3.0 |
486 | 1.9 |
用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋2份人EDTA血漿樣本并進行分析。以pg/mL為單位的結果如下：
# |
稀釋 |
觀測值 |
預期值 |
回收率 % |
1 |
純品 |
286 |
- |
- |
| 1:2 | 138 | 143 | 96 |
| 1:4 | 75 | 72 | 104 |
| 1:8 | 37.9 | 36 | 105 |
| 1:16 | 19.5 | 18 | 108 |
2 | 純品 | 61.8 | - | - |
| 1:2 | 32.1 | 30.9 | 104 |
| 1:4 | 15.9 | 15.5 | 103 |
| 1:8 | 7.2 | 7.7 | 94 |
向兩份患者樣本中加標不同量的人完整FGF-21(1 vol. + 1 vol.)?；旌衔铮┎y定。結果單位為ng/mL，如下所示：
# |
初始值 |
加標量 |
觀察值 |
預期值 |
恢復 % |
1 | 45.9 | 91 | 64.9 | 68.5 | 95 |
| （血清） | 255 | 150 | 151 | 100 |
|
| 714 | 388 | 380 | 102 |
2 | 40.4 | 91 | 71.2 | 65.7 | 108 |
| （血漿） | 255 | 148 | 148 | 100 |
714 | 406 | 377 | 108 |
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