金免疫技術的特點是以膠體金作為標記物。這一技術在70年代初期由Faulk和Taylor始創，zui初用于免疫電鏡技術。迄今為止，金標記仍主要用于免疫組織化學中。在免疫測定中，金標記常與膜載體配合，形成特定的測定模式，典型的如斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等，已是目前應用廣泛的簡便、快速檢驗方法。
*節免疫膠體金的制備
一、膠體金的特性和制備
（一）膠體金的結構
膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表面的是內層負離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態。膠體金顆粒的基礎金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態。
（二）膠體金的特性
1．膠體性質膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩定地、均勻地、呈單一分散狀態懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質的敏感性。電解質能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩定狀態，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來。某些蛋白質等大分子物質有保護膠體金、加強其穩定性的作用。
2．呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。zui小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據這一特點，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。
3．光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰，這個光吸收峰的波長（λmax）在510～550nm范圍內，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長波長，反之，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長，表19-1所列為部分膠體金的λmax。
（三）膠體金的制備
1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據還原劑類型以及還原作用的強弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。zui常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：
（1）將HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
（2）攪動下準確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。
（3）繼續加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成紅色。全過程約2～3min。
（4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積。
用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時檸檬酸三鈉的用量。
表19-1 四種粒徑膠體金的制備及特性
膠體金粒徑（nm） 1％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性
呈色 λmax
16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙紅 522nm
41 1.00 紅色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm
*還原100ml0.01％HauC14所需量
2．注意事項
（1）氯金酸易潮解，應干燥、避光保存。
（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。
（3）用于制備膠體金的蒸餾水應是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質量的去離子水。
（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是清潔的，用前應先經酸洗并用蒸餾水沖凈。是經硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。
（5）膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質量的膠體金卻也并非易事。因此對每次制好的膠體金應加以檢定，主要檢查指標有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無凝集顆粒等。
肉眼觀察是zui基本也是zui簡單和方便的檢定方法，但需要一定的經驗。良好的膠體金應該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計制得的金顆粒的大小。當然也可用分光光度計掃描λmax來估計金顆粒的粒徑。結制備的膠體金作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較地測定膠體金的平均粒徑。
膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當時會有細菌生長或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標記，使用時為提高標記效率可先低速離心去除凝集顆粒。
二、免疫金的特性和制備
（一）免疫金的特性
膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組織化學技術中，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質（抗原或抗體）結合，這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物，或簡稱免疫金（immunogold）。
膠體金與蛋白質結合的機制尚有十分清楚，一般認為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質表面的陽性電荷通過靜電感應相附。因此環境pH和離子強度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質的分子量及蛋白質濃度等也會影響蛋白質的吸附。
（二）免疫金的制備
1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調節膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標記蛋白質等電點，也可略為偏堿。但通常zui適反應pH往往需經多次試驗才能確定。在調節膠體金的pH值時應注意，膠體金會阻塞pH計的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩定膠體金后，再膠體金的pH值。
2．將1/10體積的合適濃度的蛋白質溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應2～5min。由于鹽類成分能影響膠體金對蛋白質的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標記蛋白質溶液若含有較高的離子濃度，應在標記前先對低離子強度的蒸餾水透析去鹽。
3．加入濃度為0.2％的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。
4．離心分離，去除上清液中未結合的蛋白質。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對5nm金顆粒可選用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。
5．輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復原體積后再離心。如此洗滌2～4次。以*除去未結合的蛋白質。
6．免疫金復合物zui終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。
多種蛋白質、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩定劑，PEG和BSA是zui常用的穩定劑。穩定劑有兩大作用：一為保護膠體金的穩定性，使之便于長期保存；二為防止或減少免疫金復合物的非特異性吸附反應。穩定劑的合理選擇是十分重要的，不適當的穩定劑有時也會導致非特異性反應。
第二節
一、 膠體金
即金的水溶液，它也具有一般溶膠的特性。分散體系的分類：體系就是一定空間范圍內作為我們研究對象的物質，某一種或幾種物質分散到另一種物質中所組成的體系叫做分散體系。被分散相質點的大小而改變，因此，按分散相質點的大小不同，可將分散體系分為三類。
（一）離子分散體系
指分數散相以小分子或離子狀態分散著。這種溶液具有高度穩定性，無論放置多久，分散相顆粒都不會因重力而下沉，不會從溶液中分離出來
（二）膠體分散體系
是指分散相顆粒在1～100nm之間的分散體系叫做膠體分散系。膠體溶液外觀透明不渾濁，在普通顯微鏡下看不見它的分散相粒子，不易受重力影響與分散介質分離沉降，但其中的溶膠粒子有聚結變大的傾向，即具有聚結不穩定性。
（三）粗分散體系
分散相顆粒是由許多分子組成，因粒子較大，用肉眼或顯微鏡即可看見，不穩定，極易因重力而自動沉降，外觀渾濁不透明。
二、膠體金的一般性狀
（一）膠體金的顏色
溶膠的顏色決定于分散相物質的顏色、分散相物質的散度和入射光線和種類，是散射光還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長越短，對同一種物質的水溶膠來說，粒子大小不同，顏色亦不同，膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長520nm，呈葡萄酒紅色，20～40•nm之間吸收波長530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。
（二）膠體金的穩定性
溶膠的穩定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的顆粒作布朗運動，不易受重力影響下沉。然而溶膠又是不穩定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積較大，當膠粒相互碰撞時，有自動合并為較大、較重的顆粒傾向。膠體顆粒變大以致超出膠體范圍而從介質中沉淀出來的現象叫聚沉。影響溶膠穩定性的主要原因有三點：①膠粒間的相互吸引力。當膠粒相距很近時，這種吸引力可能導致膠粒合并變大。②膠粒及其溶劑化層（溶劑是水就是水化層）的帶電情況。一種溶膠的各個膠粒都帶有相同的電荷。同性電荷相斥，雙電層愈厚，膠粒帶電量愈大，排斥力愈大，愈能阻止膠粒合并聚結，溶膠愈穩定。③膠體界面的溶劑膜，當二固體間夾有一厚層液體時，這層液體膜有一個反抗二固體接近的排斥力。兩個膠粒要進一步接近，只有克服它們之間的溶劑化膜的斥力才有可能，因此溶劑膜的斥力是使溶膠穩定的原因之一。
（三）溶膠的聚沉現象
膠粒之間存在吸引力與排斥力這對矛盾，在溶膠顆粒帶電及溶劑化的情況下，排斥力成為矛盾的主要方面，溶膠穩定而不聚沉。因為某種原因使溶膠顆粒帶電量減到很小甚至中和；其所帶電荷并能去溶劑化膜，膠粒之間可在更近的距離互相接近，引力成為主要矛盾，引力超過斥力時膠粒便聚結發生聚沉。引起溶膠聚沉的原因有：
1．少量電介質對溶膠的聚沉作用 少量電介質即可使溶膠聚沉，但各種電介質的聚沉能力可用聚沉值來表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值從實驗中得出如下的離子價規則：①電介質負離子對帶正電的溶膠起主要聚沉作用，正離子對帶負電的溶膠起主要聚沉作用。②同價離子聚沉能力幾乎相等，不同價離子的聚沉能力隨離子價的增加而顯著增加。電介質為什么能使溶膠聚沉呢？這是由于電介質與膠粒帶相反電荷的離子的作用，中和了膠粒所帶的一部分電荷，使膠粒電荷量減少，擴散層縮小，溶劑化層變薄，而當雙電層厚度縮至很小的溶劑化層變得很薄時，兩個膠粒間便可以更加接近即不產生斥力，兩個膠粒間因引力加大而合并的趨勢增強，甚至引力占優勢以致使膠粒聚結而發生聚沉。膠粒的雙電層結構見圖5
2．溫度對溶膠穩定性的影響一般影響不大，當溫度升高時，吸附能力減弱，溶劑化程度降低，溶劑化層變薄，膠粒聚結，不穩定性增加。
3．濃度對溶膠的穩定性的影響濃度增大時，粒子間距離縮小，引力增加，容易聚結而發生聚沉，所以制備比較穩定的溶膠，要有一定的合適濃度。
第三節膠體金的制備技術
膠體金溶液的制備有許多種方法，其中zui常用的是化學還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。
一、制備膠體金的
（一）玻璃器皿的清潔
制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關鍵的一步。如果玻璃器皿內不干凈或者有灰塵落入就會干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無色或混濁不透明。我們的經驗是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸泡24h，自來水洗凈清潔液，然后每個玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經制備的膠體金溶液，用同等大不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因為減少了金顆粒的吸附作用。
（二）試劑的配制要求
（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱內保存長達幾個月至1年左右，仍保持穩定。
（3）白磷或黃磷乙----溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準備好的乙------中去，輕輕搖動，等*溶解后即得飽和溶液。儲藏于棕色密閉瓶內，放在陰涼處保存。
二、制備膠體金的方法和步驟
（一）白磷還原法
1．白磷還原法（Z Sigmondy 1905年）
（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。
（2）用0.2mol/L K2CO3調pH至7.2。
（3）加熱煮沸騰，迅速加入0.5ml
20%白磷的飽和乙------溶液，振蕩數分鐘至溶液呈現橙紅色時即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右，大小較均勻。
2．白磷還原法（Z Sigmondy 1905及Z Sigmondy Thiessen 1925）
（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加雙蒸水120ml 。
（2）用0.2mol/L K2CO3,調pH至中性。
（3）加入1/5飽和度的白磷乙------溶液1ml（1份白磷4份乙------），在室溫振蕩約15min，溶液呈紅褐色，再加熱至典型的葡萄酒紅色，加熱可使乙------蒸發，膠體金液體內過量的白磷通入空氣后被氧化，此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5～12nm之間。
3．白磷還原法的改良法（Henegouwen 1986）
（1）取20%飽和度白磷乙------溶液0.5ml,加雙蒸水60ml 。
（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml, 加0.1mol/L K2CO30.6ml, 振蕩變成棕紅色。
（3）加熱煮沸，至溶液變成透明紅色。
使用上述方法增加還原次數使金顆粒直徑不斷增大，二者之間的關系見表5-1。
表5-1 膠體金顆粒大小與還原次數之間的關系
還原次數顆粒直徑（nm）正負誤差
15.60.9
26.70.9
37.90.9
49.81.3
5121.0
此方法主要優點是簡化了制備不同大小的顆粒膠體金的手續和其它試劑的配制,經濟、操作簡單。另外，在多次還原過程中氯化金不再形成新的金顆粒，只是在原先金粒子基礎上使它的直徑變大。*次金顆粒起著“晶核”的作用。由于這一特點，制備的金顆粒相對均勻一致。
（二）抗體血酸還原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）將在4℃預冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。
（2）在攪拌下加入1ml 0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現紫紅色。
（3）加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變為透明紅色為止。膠體金顆粒直徑為8～13nm。
（三）檸檬酸三鈉還原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年創立的，制備程序很簡單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現紅色，煮沸7～10min出現透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見表5-2。
表5-2 檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關系
0.01%的HAuCl4（ml）1%檸檬酸三鈉（ml）直徑（ml）
1005.010.0
1004.015.0
1001.525.0
1001.050.0
1000.7560.0
1000.6070.0
1000.4298.0
1000.32147.0
1000.25160
按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來。許多研究證明用該法制備膠體金時金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數，基本的規律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。
（四）鞣酸?檸檬酸三鈉還原法（Slot與Gueeze1985年）
該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎，1985年Slot與Geuze對該法進行了改良，特點是通過改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標及多標研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見表5-3。
表5-3 鞣酸?檸檬酸三鈉還原法
A 液B 液
直徑（nm）1%檸檬酸鈉（ml）0.1mol/L
K2CO3ml1%鞣酸（ml）H2O（ml）1%HAuCl4（ml）H2O（ml）
3.340.2411.8179
540.20.715.1179
1040.0250.115.875179
1540.00250.0115.987179
操作步驟：
（1）根據所需要的膠體金顆粒分別配制A液和B液。
（2）將配制好的A、B兩液在水浴內加熱到60℃，并通過控溫裝置使溫度保持穩定。
（3）在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，繼續加熱直至膠體金變成葡萄酒色，時間大約7～10min。在A、B兩液混合后可見溶液立即變成藍色，大約1～3 min就變成紅色。
用鞣酸?檸檬酸三鈉還原法，檸檬酸三鈉主要為還原劑，而鞣酸則有雙重作用，一是還原作用，二是保護作用，控制“晶核”的形成過程，也就是說鞣酸的用量多少決定膠體金顆粒的大小形成，因此改變鞣酸的用量就可以改變膠體金的顆粒大小，達到制備不同直徑顆粒的膠體金之目的。
（五）乙醇超聲波還原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶濃0.2ml加入100ml雙蒸水。
（2）用0.2molK2CO3調pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超聲波探頭浸入溶液內進行超聲振蕩，由此法制得的膠體金顆粒為6～10nm。
（六）硼氫化鈉還原法（Tschopp et al 1982）
（1）將預冷在4℃的40ml雙蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在攪拌下，迅速加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重復加入3～5次，直至溶液的蘭紫色變為橙紅色為至。然后再攪拌5min，獲得的金顆粒直徑在2～5nm之間。
（七）放射性膠體金的制備方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加熱至沸騰。
（2）加入40μl19u。
（3）迅速加入4ml1% 檸檬酸三鈉水溶液，5～7min出現透明的橙紅色。
（4）其含量為I×106脈沖數/min。
（八）微波制備液體金方法。
第四節膠體金的質量鑒定
膠體金制備完畢后須經電鏡下質量鑒定才能應用
一、膠體金顆粒直徑測定
用預先處理好的覆有Formvar膜的鎳網浸入膠體金溶液內，取現放在空氣中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射電鏡下觀察，主要觀察金顆粒的大小，符合不符合所需要的顆粒直徑，金顆粒是否均勻一致，有無橢圓形及多角形金顆粒存在。理想的金顆粒是大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在，還可以拍片放大后測量金顆粒直徑的大小。
二、膠體金金顆粒均勻度測定
一般需測量100個以上的膠體金顆粒，然后用統計學處理，計算膠體金顆粒的平均直徑及標準差，前者反映顆粒的大小，后者說明顆粒是否均勻一致。
三、影響膠體金顆粒大小的因素
如果有較多的大小不等的金顆粒及有橢圓形，三角形金顆粒存在應重新制備。一般造成這種情況的主要原因是在加還原劑的時候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者攪拌不均勻，速度太慢沒有攪拌起來，造成了顆粒大小不等。制備量的多少，容器的大小，加熱的時間等也影響膠體金顆粒的大小。制備了合格的膠體金以后，放在室溫或4℃保存。避免低溫凍存，因為凍存可導致膠體金凝集，破壞了膠體狀態。膠體金在室溫避光無灰塵的環境中可放置3個月左右。冰箱內半年左右。根據膠體金的性質，有不穩定和聚沉的可能性，因此，制備完畢后在20天以內進行標記。
第五節膠體金標記物的制備
膠體金標記蛋白質的原理，一般認為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質等電點時，蛋白質呈電中性，此時蛋白質分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質分子的表面張力卻zui大，處于一種微弱的水化狀態，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質分子牢固地結合在金顆粒的表面，形成一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩定狀態，如果＝低于蛋白質的等電點時，蛋白質帶正電荷，膠體金帶負電荷，二者極易靜電結合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質等電點時，蛋白質帶負電荷，與金顆粒的負電荷相互排斥而不能互相結合。為防止蛋白質與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩定劑。用Sephacryb
S?400 （丙烯葡聚糖S?400 ）層析分離純化膠體金蛋白標記物只適用于以BSA作穩定劑者。
一、待標記蛋白質的準備
（1）透析除鹽：蛋白質溶液內應除去多余的電解質，不然過高的鹽類物質會降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質的吸附，因此，標記之前必須*除鹽。一般將蛋白質置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水（0.005mol/L NaCl , pH7.0）透析。
（2）去除蛋白質中的沉淀：長期低溫保存的蛋白質或4℃較長時間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對標記過程及免疫金探針的穩定性有一定影響，因此，標記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調整蛋白質濃度至1mg./ml即可用于標記。
二、膠體金pH值的調整
膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質等電點（PI）略偏堿的條件下二者才能牢固地結合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏堿。需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可。
幾種常用的蛋白質標記時膠體金所用的pH值見表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質標記時膠體金所用的pH值如下
蛋白質pH
抗體（γ球蛋白）9.0
親合層析的IgG7.6
單克隆抗體8.2
F（ab'）27.2
SPA（葡萄球菌蛋白）6.0
蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0
蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0
花生凝集素6.3
Helix pomatia lectin7.4
大豆凝集素6.1
Lens Culinaris lectin6.9
Lotus Tetragonolobus lectin6.3
荊豆凝集素6.3
Bandeirae simplicifolia lectin6.2
過氧化物酶8.0
類卵粘蛋白4.8
血漿銅蘭蛋白7.0
α-胎球蛋白6.5
小牛血清白蛋白6.5
牛血清白蛋白5.5
牛血球白蛋白結合肽4.5
牛血清白蛋白結合胰島素5.3
霍亂毒素6.9
破傷風毒素6.9
DNAase6.0
RNAase9.0
低密度脂蛋白5.5
α2-巨球蛋白6.0
抗生物素蛋白（親合素）10.0
鏈霉抗生物素蛋白6.6
麥胚凝集素9.9
三、待標記蛋白質zui適穩定量的測定
（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測定，以OD值為縱坐標，蛋白質用量為橫坐標作一曲線，取曲線zui先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質用量為zui適穩定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質的zui適穩定量為45μg/ml
（2）目測法：以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例，將標記的蛋白質逐級稀釋后（由5μg～45μg另設對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進行。
表5-5 具體的做法是按表內進行
管數12345678910
膠體金（ml）1111111111
蛋白質（μg）510152025303540450
10%NaCl（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1
①當分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結果。
②沒有加入蛋白質的管為對照管。
③小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個管內應加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍色及聚沉現象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩定膠體金的試管，即呈現由紅變藍的聚沉現象，而加入蛋白量達到或超過zui低穩定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量zui低的試管即含穩定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎上再加上20%即為穩定所需蛋白質的實際用量。
四、蛋白質的膠體金標記
當蛋白質的zui適穩定量及標記的*pH值被確定以后便可進行標記。具體步驟如下：
（1）根據用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質的總量。
（2）在電磁攪拌下，將蛋白質溶液加入膠體金溶液中（pH已調至PI超過0.5pH），加入蛋白質時應逐滴加入，1mg的蛋白質大約5min加完。
（3）在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEG MW20000）使其終濃度為0.05%,
我們對比了BSA和PEG穩定膠體金的效果，BSA穩定的標記膠體金，放在4℃達2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩定的標記膠體金放在4℃1年左右就有分層現象，而且染色*下降。因此，我們認為還是用BSA作穩定劑。
（4）將標記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時，不要濃縮。
五、膠體金標記蛋白質的純化
標記好的免疫金探針必須經過純化處理以后才能用于免疫細胞化學染色。純化的目的是除去其中未標記的蛋白質，未充分標記的膠體金以及在標記過程中可能形成的各種聚合物。
（一）調整與超速離心法
（1）將標記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
（2）一般在10nm以上所標記的膠體金均可在調整離心機上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./L
TBSpH8.2（內含1%BSA，0.05%疊氮鈉）溶解，重復離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存備用。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉速（見表5-6），離心純化時所用轉速見表5-7，膠體金的OD值見表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時所用轉速參考表
膠體金顆粒直徑（nm）蛋白質時間（min）轉速（r）
3.0GAR IgG6030000
5.0GAR IgG5025000
10.0RAM IgG5019000
15.0SPA4017000
15.0ALcc IgG4017000
20.0SPA4013000
25.0SPA3512000
說明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAM IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時所用轉速
膠體金顆粒（nm）pH蛋白質轉速（xg）時間（min）
59.0羊抗人IgG4500045
108.2抗胃癌單克隆抗體4500030
156.5鏈霉親和素1200045
206.0SPA1200030
將純化好的膠體金用0.02mol/L TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
膠體金顆粒大?。?/span>nm）OD（520）nm
52.5
102.5
153.5
205.0
（二）凝膠過濾法
為純化免疫金探針的方法，其特點是簡便，過濾的膠體金顆粒比較均勻，不容易凝集，而離心方法轉速高，時間長，膠體金顆粒沉淀容易凝集，用凝膠過濾克服了這一弱點。選用本方法時膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩定劑。具體操作過程如下：
（1）將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過柱。
（2）柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。
（3）丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls?400 , Pharmacia, Sweden）裝柱后用0.02mol/L pH8.2
TBS平衡層析柱（pH7.4者用于標記的SPA），平衡好后，吸取上清膠體金液體加入層析柱內，加樣時請注意不要破壞S?400的界面。
（4）用0.02mol/L pH8.2
TBS洗脫，先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體，緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金，注意顏色的變化，如紅色變淡，變黃立刻停止收集。如Sephacryls?400沒有，也可以用Sepharose ?4B或6B代替（Pharmacia, Sweden）也能收到較好的效果。
六、免疫金探針的鑒定
（1）用有Formvar
膜的鎳網沾取金標蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾復染，在TEM下觀察，可見金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表面吸附有蛋白質分子。
（2）純化后免疫金探針是否保持很好的生物學活性是判斷其質量好壞的主要指標，因此，在使用之前必須對它的特異性，敏感性進行鑒定。鑒定舉例，用陽性抗原片，脫蠟至水，胰蛋白酶消化，加*抗體（多克隆或單克?。?，一般過夜再加標記抗同一抗特異性抗體結合的膠體金溶液（多克隆或單克隆抗體標記的膠體金）詳細方法步驟見后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀釋SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀釋，37℃45min，沖洗，顯色，觀察結果，染色效價以陽性結果明確，背景淺的稀釋度為標準。免疫細胞化學染色試驗可以較全面地反應免疫金探針的質量。
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