Sigma-Aldrich 的天然蛋白去糖基化試劑盒(Native Protein Deglycosylation Kit,貨號NDEGLY)可在天然條件下去除糖蛋白上的N連接寡糖。糖基化蛋白修飾通常位于折疊蛋白中不容易接近的位置,因此在未變性的情況下,不大可 能通過標準的肽N- 糖苷酶 F(PNGase F)處理來去除。如果您的下游分析需要折疊蛋白(如酶學分析或蛋白相互作用分析),那么這個試劑盒也許適合您。
此試劑盒包含了內糖苷酶F1、F2和F3,以及相應的反應緩沖液。與PNGase F相比,這些內糖苷酶對蛋白構象沒那么敏感,更適合在蛋白未變性的情況下去除各種N連接寡糖。這三種內糖苷酶有著不同的連接特異性。F1能夠去除低聚甘露 糖和混合寡糖結構,而F2和F3則分別能去除兩個分支和三個分支的結構。
此試劑盒在去糖基化上的效果如何呢?美國西北大學的博士生A. Caulfield介紹了他的使用心得。
據Caulfield介紹,他們想要確定目的蛋白在去糖基化之后的生物學活性。糖基化的 去除可通過Western blot來評估,即蛋白條帶的分子量減少。他們的目的蛋白包含N連接糖基化。此蛋白在HEK 293細胞中產生,并利用其N端的FLAG標簽來純化。之前他們試過PNGase,但無法讓目的蛋白去糖基化。
在這一實驗中,他們將2 ug目的蛋白與0.02個單位的內糖苷酶F1、F2或F3及其相應的緩沖液混合,在37°C孵育4小時。之后通過標準的SDS-PAGE和Western blot來評估去糖基化的程度。
正如他們預計的那樣,蛋白被去糖基化,且各個樣品之間的結果相當一致。有趣的是,內糖苷酶F1對他們的蛋白起作用,而F2和F3則*沒效果。Caulfield認為,了解哪種酶能使蛋白去糖基化,將帶來一些有關寡糖鏈性質的信息。
Caulfield認為這一試劑盒簡單易用,適用于所有研究蛋白糖基化的研究人員。當然,隨著蛋白底物不同,反應條件可能也需要調整。
Sigma-Aldrich提供了多種去糖基化試劑盒,包括GlycoProfile I In-Gel Deglycosylation Kit、GlycoProfile II Enzymatic In-Solution Deglycosylation Kit、GlycoProfile IV Chemical Deglycosylation Kit等,適用于溶液或PAGE膠中的糖蛋白,與下游多個分析(如質譜分析或功能研究)兼容。
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