PEI轉染的方法
常規轉染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,一類是穩定轉染(*轉染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說,超螺旋質粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72小時內(依賴于各種不同的構建)分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩定轉染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標記,如來氨丙基轉移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩定轉染的同源細胞系。
PEI轉染的方法
材料:質粒DNA 指數生長的真核細胞 PEI (聚乙烯亞胺,是線性的) 1×HBS (pH7.4)
配方: PEI 儲存液(100 μM):稱取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS (pH7.4)
中, 0.2 μm 濾膜過濾,儲存于4℃備用。
1×HBS (pH7.4): 將8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超純水,加入20 ml 1 M 的
HEPES,調pH 值到7.4,定容至1 L,過濾(0.2 μm 濾膜)后儲存于4℃備用。
方法:
1.細胞分盤: 通過胰酶消化收集細胞,用適當的*培養基以4×105 至8×105
細胞/cm2 的密度平鋪細胞于60 mm 組織培養皿上(根據實驗需要選擇培養皿,
使細胞貼壁后所占總面積達到培養皿面積的70-90%)。根據細胞貼壁情況于
含5% CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當細胞貼壁*后即可開始轉染。轉染
前換入2 mL 預熱的無血清培養基。
2. 制備PEI-DNA 混合物:以60 mm 組織培養皿用420 μL 反應總體積為例。準
備兩支1.5 mL 離心管,一管將質粒DNA(總量2-8 μg 為佳)加入240 μL HBS
中,混勻。另一管中則用HBS 將100 μM 的PEI 儲存液稀釋成10 μM,充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中,充分混勻后
室溫靜置20-30 min。zui后將這420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述單層
細胞的細胞培養基中,輕輕搖動平皿混勻,置于含5%~7% CO2 的37℃ 溫箱
孵育。
注:每次用100 μM 的PEI 儲存液前都需要先將其充分混勻,保證所取的
濃度一致。
3. 培養6-10 h 后更換為37℃預熱的含有血清的培養基,繼續培養,16 h 左右
可以觀測到報告基因的表達。
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